細(xì)菌活力藍(lán)色熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)菌活力藍(lán)色熒光檢測試劑是一種旨在通過使用熒光染料DAPI與染色體DNA的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號來測定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌之比例的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種環(huán)境樣品（河水、海水、市政廢水、可飲用水、土壤、沉積物等）和食物樣品的細(xì)菌檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，熒光清晰。
技術(shù)背景
作為細(xì)胞DNA染色劑之一的4，6－二咪基－4-聯(lián)苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole； DAPI）特異性地與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好是UV（紫外光）的激發(fā)波長356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液（Reagent A） 毫升
固定液（Reagent B） 毫升
染色液（Reagent C） 微升
裂解液（Reagent D） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月
用戶自備
針筒式過濾器：用于除去樣品中的液體成分
濾膜（0.2微米孔徑的硝基纖維素或醋酸纖維素或聚碳酸酯濾膜）：用于收集稀釋液體中的細(xì)菌
微型臺式離心機(jī)：用于細(xì)菌沉淀收集
1.5毫升離心管：用于細(xì)胞檢測操作的容器
碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染料：用于檢測死亡的細(xì)菌
37℃培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
熒光顯微鏡：用于觀察染色后具熒光的細(xì)菌
1
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，開啟熒光顯微鏡預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作：
一、 液體樣品檢測（河水、海水、市政廢水、可飲用水、液體食物等）
1． 準(zhǔn)備好針筒式過濾器，濾膜為1厘米直徑和0.2微米孔徑的硝基纖維素或醋酸纖維素或聚碳酸酯
2． 移取10毫升液體樣品到針筒式過濾器
3． 真空過濾
4． 準(zhǔn)備1個1.5毫升離心管
5． 加入xx微升緩沖液（Reagent A）
6． 選擇下列方法之一繼續(xù)操作：
方法一：熒光日光法
1. 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3. 再加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
5. 小心加入上述離心管中所有溶液到針筒式過濾器里的濾膜上，鋪滿整個表面
6. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照和液體蒸發(fā)
7. 真空過濾移去濾膜上的染色溶液
8. 小心移出濾膜
9. 置于載波片上
10. 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)活細(xì)菌量：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
11. 關(guān)掉熒光，開啟白光，觀察并計數(shù)總細(xì)菌量
12. 建議觀察20個顯微鏡視野，確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二：雙重染色
1． 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3． 再加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4． 繼續(xù)加入1微升（1微克/微升）用戶自備的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液
5． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
6． 小心加入上述離心管中所有溶液到針筒式過濾器里的濾膜上，鋪滿整個表面
7． 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照和液體蒸發(fā)
8． 真空過濾移去濾膜上的染色溶液
9． 小心移出濾膜
10．置于載波片上
11．即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
12．變更到紅色熒光濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13．建議觀察20個顯微鏡視野，確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
2
二、固體樣品檢測（土壤、沉積物、食物等）
1． 準(zhǔn)備好1克固體樣品
2． 移入到1.5毫升離心管
3． 加入xx毫升緩沖液（Reagent A）
4． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
5． 靜置1分鐘
6． 即刻移取100微升上清液體到新的1.5毫升離心管
7． 選擇下列方法之一繼續(xù)操作：
方法一：熒光日光法
1． 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3． 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
6． 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀上
7． 放上蓋玻片
8． 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)活細(xì)菌量：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
9． 關(guān)掉熒光，開啟白光，觀察并計數(shù)總細(xì)菌量
10．建議觀察20個顯微鏡視野，確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二：裂解法
1． 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3． 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，避免光照
6． 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀上的一側(cè)樣品池里
7． 加入xx微升裂解液（Reagent D）到1.5毫升離心管
8． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
9． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
10．再移出10微升離心管中的混勻物到新的載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀上的另一側(cè)樣品池里
11．放上蓋玻片
12．即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌，而顯示暗淡或無熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13．建議觀察20個顯微鏡視野，確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法三：雙重染色
1. 加入xx微升固定液（Reagent B）到1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4. 再加入xx微升（1微克/微升）用戶自備的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液
5. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻 3
6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
7. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀
8. 放上蓋玻片
9. 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
10. 變更到紅色熒光濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
11. 建議觀察20個顯微鏡視野，確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
處理三：菌液樣品（培養(yǎng)細(xì)菌等）
1. 移取1毫升細(xì)菌培養(yǎng)瓶里的新鮮菌液到新的1.5毫升離心管
2. 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心30秒，速度為16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
3. 小心抽去上清液
4. 加入xx毫升緩沖液（Reagent A），充分混勻
5. 移出100微升細(xì)菌樣品到新的1.5毫升離心管
6. 選擇下列方法之一繼續(xù)操作：
方法一：熒光日光法
1. 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
5. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀
7. 放上蓋玻片
8. 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)活細(xì)菌量：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
9. 關(guān)掉熒光，開啟白光，觀察并計數(shù)總細(xì)菌量
10. 建議觀察3個顯微鏡視野，確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二：裂解法
1. 加入xx微升固定液（Reagent B）到1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
5. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀上的一側(cè)樣品池里
7. 加入xx微升裂解液（Reagent D）到1.5毫升離心管
8. 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
9. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
10. 移出10微升離心管中的混勻物到新的載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀的另一側(cè)樣品池里
11. 放上蓋玻片
12. 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌，而顯示暗淡或無熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13. 建議觀察3個顯微鏡視野，確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
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方法三：雙重染色
1． 加入xx微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升離心管
2． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
3． 加入xx微升染色液（Reagent C）到離心管
4． 再加入xx升（1微克/微升）用戶自備的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液
5． 用手指輕輕彈動離心管，使其充分混勻
6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
7． 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計數(shù)儀上
8． 放上蓋玻片
9． 即刻在熒光顯微鏡（1000倍）紫外波長濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
10．變更到紅色熒光濾波器下，觀察并計數(shù)：顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
11．建議觀察3個顯微鏡視野，確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
注意事項
1． 本產(chǎn)品為50次操作
2． 操作時，須戴手套
3． DAPI為半通透性的染料，可以自由進(jìn)入細(xì)菌
4． 本產(chǎn)品的裂解液（Reagent D），通常情況下，可以充分溶解細(xì)菌細(xì)胞，但不排除不同菌種的耐受力；亦可使用異丙醇替代
5． 細(xì)菌稀釋性樣品（例如河水等）建議觀察20個視野計數(shù)；濃縮性樣品（例如培養(yǎng)菌等）建議觀察3個視野計數(shù)
6． 使用載波片細(xì)菌計數(shù)活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌比例時，建議每個視野計數(shù)200個細(xì)菌
7． 使用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計數(shù)器（Hemocytometer）的計算方法是：
1毫米方塊的細(xì)菌計數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)菌數(shù)/毫升
8． 建議細(xì)菌染色后即刻進(jìn)行觀察分析，zui長不得超過2小時
9． 本公司提供系列細(xì)菌分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰
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