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當(dāng)前位置:上海宸功生物技術(shù)有限公司>>技術(shù)文章>>細(xì)菌活力藍(lán)色熒光檢測試劑盒
細(xì)菌活力藍(lán)色熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)菌活力藍(lán)色熒光檢測試劑是一種旨在通過使用熒光染料DAPI與染色體DNA的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號(hào)來測定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌之比例的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種環(huán)境樣品(河水、海水、市政廢水、可飲用水、土壤、沉積物等)和食物樣品的細(xì)菌檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,性能穩(wěn)定,熒光清晰。
技術(shù)背景
作為細(xì)胞DNA染色劑之一的4,6-二咪基-4-聯(lián)苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI)特異性地與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用,從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm,正好是UV(紫外光)的激發(fā)波長356nm,使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號(hào)。
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液(Reagent A) 毫升
固定液(Reagent B) 毫升
染色液(Reagent C) 微升
裂解液(Reagent D) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存染色液(Reagent C)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里,染色液(Reagent C)避免光照,有效保證6月
用戶自備
針筒式過濾器:用于除去樣品中的液體成分
濾膜(0.2微米孔徑的硝基纖維素或醋酸纖維素或聚碳酸酯濾膜):用于收集稀釋液體中的細(xì)菌
微型臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)菌沉淀收集
1.5毫升離心管:用于細(xì)胞檢測操作的容器
碘化丙啶(Propidium Iodide;PI)染料:用于檢測死亡的細(xì)菌
37℃培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物
熒光顯微鏡:用于觀察染色后具熒光的細(xì)菌
1
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,開啟熒光顯微鏡預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作:
一、 液體樣品檢測(河水、海水、市政廢水、可飲用水、液體食物等)
1. 準(zhǔn)備好針筒式過濾器,濾膜為1厘米直徑和0.2微米孔徑的硝基纖維素或醋酸纖維素或聚碳酸酯
2. 移取10毫升液體樣品到針筒式過濾器
3. 真空過濾
4. 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
5. 加入xx微升緩沖液(Reagent A)
6. 選擇下列方法之一繼續(xù)操作:
方法一:熒光日光法
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 再加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
5. 小心加入上述離心管中所有溶液到針筒式過濾器里的濾膜上,鋪滿整個(gè)表面
6. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘,避免光照和液體蒸發(fā)
7. 真空過濾移去濾膜上的染色溶液
8. 小心移出濾膜
9. 置于載波片上
10. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù)活細(xì)菌量:顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
11. 關(guān)掉熒光,開啟白光,觀察并計(jì)數(shù)總細(xì)菌量
12. 建議觀察20個(gè)顯微鏡視野,確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二:雙重染色
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 再加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 繼續(xù)加入1微升(1微克/微升)用戶自備的碘化丙啶(Propidium Iodide;PI)染液
5. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
6. 小心加入上述離心管中所有溶液到針筒式過濾器里的濾膜上,鋪滿整個(gè)表面
7. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘,避免光照和液體蒸發(fā)
8. 真空過濾移去濾膜上的染色溶液
9. 小心移出濾膜
10.置于載波片上
11.即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
12.變更到紅色熒光濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13.建議觀察20個(gè)顯微鏡視野,確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
2
二、固體樣品檢測(土壤、沉積物、食物等)
1. 準(zhǔn)備好1克固體樣品
2. 移入到1.5毫升離心管
3. 加入xx毫升緩沖液(Reagent A)
4. 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,充分混勻
5. 靜置1分鐘
6. 即刻移取100微升上清液體到新的1.5毫升離心管
7. 選擇下列方法之一繼續(xù)操作:
方法一:熒光日光法
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
5. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上
7. 放上蓋玻片
8. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù)活細(xì)菌量:顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
9. 關(guān)掉熒光,開啟白光,觀察并計(jì)數(shù)總細(xì)菌量
10.建議觀察20個(gè)顯微鏡視野,確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二:裂解法
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
5. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘,避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上的一側(cè)樣品池里
7. 加入xx微升裂解液(Reagent D)到1.5毫升離心管
8. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
9. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
10.再移出10微升離心管中的混勻物到新的載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上的另一側(cè)樣品池里
11.放上蓋玻片
12.即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌,而顯示暗淡或無熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13.建議觀察20個(gè)顯微鏡視野,確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法三:雙重染色
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 再加入xx微升(1微克/微升)用戶自備的碘化丙啶(Propidium Iodide;PI)染液
5. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻 3
6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
7. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
8. 放上蓋玻片
9. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
10. 變更到紅色熒光濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
11. 建議觀察20個(gè)顯微鏡視野,確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
處理三:菌液樣品(培養(yǎng)細(xì)菌等)
1. 移取1毫升細(xì)菌培養(yǎng)瓶里的新鮮菌液到新的1.5毫升離心管
2. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心30秒,速度為16000g (或13000RPM,例如eppendorf 5415)
3. 小心抽去上清液
4. 加入xx毫升緩沖液(Reagent A),充分混勻
5. 移出100微升細(xì)菌樣品到新的1.5毫升離心管
6. 選擇下列方法之一繼續(xù)操作:
方法一:熒光日光法
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
5. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
7. 放上蓋玻片
8. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù)活細(xì)菌量:顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
9. 關(guān)掉熒光,開啟白光,觀察并計(jì)數(shù)總細(xì)菌量
10. 建議觀察3個(gè)顯微鏡視野,確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
方法二:裂解法
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
5. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
6. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上的一側(cè)樣品池里
7. 加入xx微升裂解液(Reagent D)到1.5毫升離心管
8. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
9. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
10. 移出10微升離心管中的混勻物到新的載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的另一側(cè)樣品池里
11. 放上蓋玻片
12. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌,而顯示暗淡或無熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
13. 建議觀察3個(gè)顯微鏡視野,確定總細(xì)菌量、活體細(xì)菌量和死亡細(xì)菌量及其比例
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方法三:雙重染色
1. 加入xx微升固定液(Reagent B)到上述1.5毫升離心管
2. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
3. 加入xx微升染色液(Reagent C)到離心管
4. 再加入xx升(1微克/微升)用戶自備的碘化丙啶(Propidium Iodide;PI)染液
5. 用手指輕輕彈動(dòng)離心管,使其充分混勻
6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘,避免光照
7. 移出10微升離心管中的混勻物到載玻片上或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上
8. 放上蓋玻片
9. 即刻在熒光顯微鏡(1000倍)紫外波長濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示亮藍(lán)色熒光細(xì)菌的為活細(xì)菌
10.變更到紅色熒光濾波器下,觀察并計(jì)數(shù):顯示紅色熒光細(xì)菌的為死細(xì)菌或膜損害細(xì)菌
11.建議觀察3個(gè)顯微鏡視野,確定活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌的比例
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品為50次操作
2. 操作時(shí),須戴手套
3. DAPI為半通透性的染料,可以自由進(jìn)入細(xì)菌
4. 本產(chǎn)品的裂解液(Reagent D),通常情況下,可以充分溶解細(xì)菌細(xì)胞,但不排除不同菌種的耐受力;亦可使用異丙醇替代
5. 細(xì)菌稀釋性樣品(例如河水等)建議觀察20個(gè)視野計(jì)數(shù);濃縮性樣品(例如培養(yǎng)菌等)建議觀察3個(gè)視野計(jì)數(shù)
6. 使用載波片細(xì)菌計(jì)數(shù)活體細(xì)菌和死亡細(xì)菌比例時(shí),建議每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)菌
7. 使用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Hemocytometer)的計(jì)算方法是:
1毫米方塊的細(xì)菌計(jì)數(shù)X 104(稀釋倍數(shù))=實(shí)際細(xì)菌數(shù)/毫升
8. 建議細(xì)菌染色后即刻進(jìn)行觀察分析,zui長不得超過2小時(shí)
9. 本公司提供系列細(xì)菌分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰
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