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上海博湖生物科技有限公司
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詳解PCR技術(shù)實驗原理
2022-10-24 閱讀(945)
聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一項利用 DNA 雙鏈復(fù)制原理，在生物體外復(fù)制特定 DNA 片段的的核酸合成技術(shù)?？稍诙虝r間內(nèi)大量擴增目的 DNA 片段，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。
DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在 DNA 聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA 聚合酶，dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制，這是 PCR 的理論基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；
2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍
