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上海博湖生物科技有限公司
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提高PCR反應(yīng)的特異性方法
2022-10-31 閱讀(797)
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率達(dá)不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴(kuò)增到106倍，足夠后續(xù)實驗展開。下面分享提高PCR反應(yīng)的特異性方法：
1、巣式pcr（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的靈敏度；降低了擴(kuò)增多個靶位點的可能性；提高PCR特異性2、遞減PCR（Touch Down PCR）：前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性；循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃ 。適合用于AFLP、DNA指紋分析等。
3、熱啟動PCR：抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀到達(dá)變性溫度。如在冰上配制PCR反應(yīng)液以抑制Taq酶活性，后將其置于預(yù)熱的PCR儀中。
4、使用PCR增強(qiáng)劑：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等可以降低熔解溫度，有助于引物退火，輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。但是增強(qiáng)劑的濃度要適當(dāng)。
5、可使用engreen的PCR試劑，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和保真性。
