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上海雅吉生物科技有限公司
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細(xì)胞培養(yǎng)基本方法
2021-2-24 閱讀(1741)
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法
一)準(zhǔn)備和安裝過濾器
清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾后要檢查濾膜是否完好無損。
(二)合成培養(yǎng)基的配制
1、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。
| 培養(yǎng)基 | 品牌 | 貨號 |
|---|---|---|
| 培養(yǎng)基 | 品牌 | 貨號 |
| D-MEM/F-12 | GIBCO | 12400024 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) | GIBCO | 12800017 |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder | GIBCO | 21700075 |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder | GIBCO | 12200036 |
| Leibovitz's L-15 Medium powder | GIBCO | 41300039 |
| McCOY's 5A | SIGMA | M4892 |
| Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 11900024 |
| Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 12000022 |
| Minimum Essential Medium (MEM) powder | GIBCO | 41500034 |
| NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S MODIFICATION (F12K) | SIGMA | N3520 |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO | 31800022 |
| EGF | SIGMA | E9644 |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256-25G |
| MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED | SIGMA | M5017 |
2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?nbsp;
3、 調(diào) pH至7.2左右。
4、 加水至終體積。
5、 在超凈臺中對溶液進(jìn)行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。
6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。
(三)小牛血清的處理
市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體(近來也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。
2、 處理后的血清貯存于4℃。
3、 小牛血清在使用前好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。
(四)生長培養(yǎng)基的配制
除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。
2、按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，。
(五)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
1、應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。
2、將解凍后的細(xì)胞液在常溫條件下，1000rpm離心5分鐘。
3、棄上清，用少量培養(yǎng)基將細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至事先加入5ml*培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞混勻后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(六)傳代:
1、貼壁細(xì)胞:
對于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化，(根據(jù)經(jīng)驗(yàn))，晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml*培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。
2、懸浮細(xì)胞:
一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入*培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
(七)凍存
將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以*培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。
(八)注意事項(xiàng)
1、玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上;
2、無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上;
3、培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;
4、消化液(pH7.8)或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存;
5、培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌)。至少每月一次。
6、進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無菌臺內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開瓶(蓋)時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開后應(yīng)用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個(gè)操作過程盡量在無菌臺靠里面一點(diǎn)。
干細(xì)胞培養(yǎng)基本方法
MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)Protocol
復(fù)蘇：
- 將MEF P0細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
- 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
- 輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
- 按照MEF細(xì)胞說明書上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個(gè)T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液14 ml。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 復(fù)蘇第二天觀察，如死細(xì)胞較多，更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液，可以使細(xì)胞生長的更好。
傳代：
- 待細(xì)胞長到90%-100滿時(shí)進(jìn)行傳代，一般3-4天，具體視細(xì)胞生長情況而定。
- 吸除廢液。
- 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
- 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
- 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
- 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化。
- 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
- 按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存：
- 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
- 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
- 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
MEF*培養(yǎng)液80%，F(xiàn)BS10%，DMSO 10%
- 一般地，P0代MEF細(xì)胞傳至P3代時(shí)，可以進(jìn)行C（Sigma，M0503）處理。處理過后的MEF細(xì)胞不再增殖，可直接作為feeder使用。
- 傳至P3代的MEF細(xì)胞長至80%以上時(shí)，吸出舊的MEF*培養(yǎng)液，加入含C（終濃度10 mg/ml ）的新鮮MEF*培養(yǎng)液（以T75培養(yǎng)瓶為例，加入培養(yǎng)液的體積為10ml ）。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時(shí)。
- 吸出培養(yǎng)液，用PBS快速洗4遍以去除殘余的C。
- 消化細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)并凍存。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶鋪1´106細(xì)胞。
