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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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三重四液質聯(lián)用儀分析全血中的依維莫司
2022-5-28 閱讀(900)
摘要本研究建立了一種高靈敏度、高特異性的分析方法，用于定量分析一組 A (CsA)、依維莫司 (Eve)、 (Sir) 以及 (Tac)。該方法運行時間為 2 分鐘，適于同時定量分析全血中的所有四種分析物。
言本應用簡報介紹了一種采用 Agilent 1260 液相色譜系統(tǒng)結合配置了安捷倫噴射流技術的Agilent 6460 三重四桿質譜儀，靈敏而準確地檢測全血中四種免疫抑制藥物，A (CsA)、依維莫司 (Eve)、 (Sir) 以及 (Tac) 的分析方法。采用串聯(lián)質譜儀 (MS/MS) 和多反應監(jiān)測 (MRM) 技術，該方法中 CsA 的線性范圍為 1.95 ng/mL 到2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 的線性范圍為0.10 ng/mL 到 100 ng/mL。
實驗部分試劑和標樣為開發(fā)分析方法，除huan孢素 A-d4 和未標記的依維莫司分別購于多倫多研究化學品公司和 Sigma-Aldrich 公司外，所有未標記和標記的標準品均購于 Cerilliant 公司。所有標準品均保存在 -20 °C 環(huán)境下。使用氘代模擬內(nèi)標物 (ISTD) 以確保準確定量。分析物及其對應的內(nèi)標物在表 1 中列出。所有其他LC/MS 溶劑和試劑均購于 Sigma-Aldrich和 Honeywell 公司。經(jīng)認證的健康全血購于當?shù)氐囊患已獛臁４送?，使用了來?ChromSystems 的校準品和來自 BioRad 的質控品 (QC)，以評估該方法的準確度和精密度（表 9）。為測定線性度，將標準品加入全血中得到高濃度校準標樣，CsA 為 2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 每種為 100 ng/mL。然后用全血進行兩倍連續(xù)稀釋，以獲取剩余標準曲線濃度。線性分析中用到的分析物濃度在表 2 中列出。
樣品處理所有校準品、質控品和樣品都采用一種簡單的蛋白沉淀程序進行處理：1. 將 100 µL 的全血與 200 µL 含有內(nèi)標的沉淀試劑（0.4 M 硫酸鋅:甲醇為 1:4）混合2. 渦旋 30 s3. 以 10000 rpm 的轉速離心 4 分鐘4. 將上清液轉移至自動進樣器樣品瓶中，并使用 LC/MS/MS 分析液相色譜配置和條件使用 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)進行分析。該系統(tǒng)包括：• Agilent 1260 Infinity 二元泵 (×2)• 帶 2 位/6 通色譜柱切換閥的 Agilent1260 Infinity 柱溫箱• Agient 1260 恒溫自動進樣器為提高儀器的穩(wěn)定性，也推薦在自動進樣器針座和進樣閥之間使用在線過濾器（部件號5067-1551）。液相色譜條件在表 3、4、5 和表 6 中列出。
自動化在線樣品凈化本方法所用的 HPLC 采用兩個二元泵以實現(xiàn)自動化樣品凈化（圖 2）。樣品上樣到捕集柱，分析物保留在柱內(nèi)，然后使用第一個泵進行了沖洗。沖洗液流入廢液容器，減少了進入質譜儀的基質量。在分析物即將從捕集柱中洗脫時切換閥頭，使洗脫的分析物進入分析柱，然后通過第二個二元泵進行進一步色譜分離。
質譜條件采用使用了噴射流技術的 Agilent 6460 三重四桿質譜進行分析。*的 MRM 轉換離子對保證了對每種分析物定量分析的特異性。內(nèi)標物 (ISTD) 的使用減少了因樣品處理過程中分析物損失或者因樣品基質差異而造成的誤差。質譜條件和 MRM 轉換離子對在表 7 和表 8 中列出。
使用市售校準品 (ChromSystems) 和質控品(BioRad) 進行了日間進樣以評估該方法的準確度和穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)由 4 名不同的操作人員在 14 天的時間內(nèi)取得。每個濃度質控品的實測準確度在表 9 中列出。
結論本研究使用 Agilent 6460 三重四桿LC/MS/MS 系統(tǒng)開發(fā)了一種高通量、運行時間為 2 分鐘的分析方法，用于免疫抑制劑huan孢素 A、依維莫司、西luo莫司以及他ke莫司的定量分析。經(jīng)過簡單的蛋白沉淀后，進行自動化在線樣品凈化，大限度地減少了血液中生物化合物造成的基質效應和離子抑制。采用這種方法實現(xiàn)了全血基質中所有四種分析物可靠且快速的定量分析。所有分析物經(jīng)證實在所需的范圍內(nèi)都具有良好的線性。
