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熒光探針
熒光淬滅劑標(biāo)記的亞磷酰胺
亞磷酰胺染料
染料標(biāo)記試劑
特殊氨基酸
抗體標(biāo)記
trFluor™ 染料和試劑盒
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FAM
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AF染料

石蠟切片免疫組化步驟(新手必讀)

時間:2024/1/11閱讀:78
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第一天

 

1、脫水
(1)、65℃烤箱干烤30min。(具體時間視切片大小多少可調(diào)整,一般不要超過1h,否則容易脫片)
(2)、二甲苯Ⅰ中15min,之后二甲苯Ⅱ中15min。
(3)、在無水乙醇Ⅰ,無水乙醇Ⅱ,95%酒精,80%酒精,70%酒精中分別浸泡各5min。(2、3這兩步都是跑缸的,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有專門的缸,直接放里面就行了)
(4)、雙蒸水浸泡5min
2、微波修復(fù)抗原:將切片浸入pH6.0,0.01M枸櫞酸修復(fù)液中(配制方法見步驟末尾),電爐或微波爐加熱至92至98℃,持續(xù)15min(注意不要煮沸)。冷卻后(不能人工降溫,不能在冷卻前將切片從熱水中取出)進(jìn)行下一步。
  對于這一步,首先配制好抗原修復(fù)液(根據(jù)你的抗原在胞質(zhì)還是胞核表達(dá)而不同,胞質(zhì)的選用枸櫞酸修復(fù)液,胞核的選用EDTA修復(fù),EDTA在此暫不做詳細(xì)說明),接著將雙蒸水中浸泡后的切片放入修復(fù)液中,拿至微波爐加熱修復(fù),在此我僅述我們的修復(fù)過程以供參考。
  修復(fù)液盒子外面另外放一盛水的盒子,防止修復(fù)液沸騰蒸發(fā),首先高火烤8分鐘(具體時間視切片多少調(diào)整),發(fā)現(xiàn)修復(fù)液沸騰后立刻停止,如果未沸騰再繼續(xù)延長烤時間,結(jié)束后等待1min,接著中火烤1min30s,停1分鐘,再中火烤1min30s,停1分鐘,如此循環(huán)共計(jì)30分鐘,結(jié)束后將整個裝有抗原修復(fù)液和切片的盒子擺到陰涼處自然晾干,晾干后再進(jìn)行下一步。
3、室溫下PBS洗滌5min×3次。(切片全部浸泡在玻璃缸中加入PBS液放入搖床,5min后取出傾去液體,重新加PBS,如此洗滌3次)
4、3%雙氧水室溫孵育15min,以內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
5、室溫下PBS洗滌5min×3次。(見第3步說明)
6、封閉:滴加正常羊血清封閉液(A試劑),37℃孵育30min(具體時間長短視情況而定,時間太長可能導(dǎo)致特異性抗體也被封閉,做不出結(jié)果來)。甩去多余的液體,不沖洗。
7、滴加適當(dāng)稀釋的一抗(抗體用PBS稀釋,具體稀釋濃度見抗體說明書,一般剛開始做的時候多試驗(yàn)幾個濃度,如1:50,1:100,1:150等,以尋找出效果好的抗體稀釋濃度),4℃過夜,我們一般是將切片擺到底下盛有水的濕盒中放入4℃冰箱過夜。(舉例1:100稀釋方法:99μL的PBS中加入1μL的抗體。

 


第二天

 

8、取出昨天過夜的濕盒,37度復(fù)溫30min,PBST沖洗5min×3次。
9、滴加生物S標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG(B試劑),37 ℃孵育30 min。 
10、PBST沖洗5minX3次。
11、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(C試劑),37 ℃孵育30 min。
12、PBST 沖洗,5min×3次。
13、DAB顯色:滴加顯色液,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在3至10min之間。反應(yīng)至顯微鏡下可見棕褐色顆粒為止,蒸餾水終止反應(yīng),并用蒸餾水洗滌。顯色前先準(zhǔn)備好雙蒸水,切片從顯微鏡上拿下來后直接入水中。
14、蘇木素復(fù)染。4min后流水沖洗。(蘇木素復(fù)染時間一般3min即可,視具體情況而定)
15、分化:1%鹽酸酒精(實(shí)驗(yàn)室有專門的缸,不用自備)中浸泡,之后流水沖洗。(分化時間一般為1-2s,即將切片迅速浸入鹽酸酒精中后迅速提起)
16、藍(lán)化:氨水中浸泡30s~1min,之后流水沖洗。我們的藍(lán)化直接是將切片浸入水中浸泡10min就可以了。
17、脫水:分別在70%酒精、80%酒精、95%酒精、無水乙醇Ⅰ,無水乙醇Ⅱ各3min。(這些實(shí)驗(yàn)室有專門的缸,不用自備)
18、透明:二甲苯Ⅰ,二甲苯Ⅱ中浸泡各10min,晾干。(同上)
19、中性樹脂封片,顯微鏡觀察。(封片可干封也可濕封,濕封即浸泡完二甲苯Ⅱ之后不晾干,切片從二甲苯中撈出后迅速滴加樹脂蓋上蓋玻片)

 

各種液體配制方法:

抗原修復(fù)液中涉及到的液體:
A液——枸櫞酸(檸檬酸)5.2525g+雙蒸水250ML(易長毛,長毛后需重配)
B液——枸櫞S鈉(檸檬酸鈉)14.705g+雙蒸水500ML
抗原修復(fù)液——A液4.5ML+B液20.5ML+雙蒸水225ML
3%雙氧水——90ML雙蒸水+30%雙氧水10ML
PBS——磷S氫二鈉14.5g+氯化鈉40g+□□1g+磷酸二氫鉀1g+雙蒸水5L
PBST——PBS 2L+(Tween-20) 1ML
DAB顯色劑(配制時請關(guān)燈避光)——1ML雙蒸餾水加入DAB顯色試劑盒中的A液一滴后混勻,再加入B液、C液各一滴混勻即刻,避光保存,30min內(nèi)使用。

 


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